活性氧检测试剂盒

包装规格                             

产品编号：Ros100、Ros300、Ros500

规格：100次、300次、500次

储存条件

4ºC保存，一年有效；-20ºC保存，二年有效；

产品组成：

产品简介：

活性氧检测试剂盒（Reactive Oxygen Species Assay Kit）是一种利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。检测DCF的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。本试剂盒提供了活性氧阳性对照试剂Rosup，以便于活性氧的检测。Rosup是一种混合物，浓度为50mg/mL。

本试剂盒本底低，灵敏度高，线性范围宽，使用方便。本试剂盒可以测定100～500个样品。

使用说明：

1. 装载探针

对于刺激时间较短（通常为2小时以内）的细胞，先装载探针，后用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞。对于细胞刺激时间较长（通常为6小时以上）的细胞，先用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，后装载探针。

原位装载探针：本方法仅适用于贴壁培养细胞。按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。去除细胞培养液，加入适当体积稀释好的DCFH-DA。加入的体积以能充分盖住细胞为宜，通常对于六孔板的一个孔加入稀释好的DCFH-DA不少于1mL。37℃细胞培养箱内孵育20分钟。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

收集细胞后装载探针：按照1∶1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，细胞浓度为一百万至二千万/mL，37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3～5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。直接用活性氧阳性对照或自己感兴趣的药物刺激细胞，或把细胞等分成若干份后刺激细胞。通常活性氧阳性对照在刺激细胞20～30分钟后可以显著提高活性氧水平。

说明：仅在阳性对照孔中加入Rosup作为阳性对照，其余孔不必加入Rosup。

2. 检测

对于原位装载探针的样品可以用激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后装载探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，也可以用激光共聚焦显微镜直接观察。

3. 参数设置

使用488nm激发波长，525nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。DCF的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置检测DCF。DCF的激发光谱和发射光谱参考下图。

使用活性氧检测试剂盒(Reactive oxygen species assay kit)显示CHO细胞内活性氧荧光。左图：CHO细胞用试剂盒配备的活性氧阳性对照处理；右图：正常CHO细胞。绿色荧光表明细胞活性氧急剧增加，并能显示其定位。

4. 其它说明

阳性对照可以按照1∶1000的比例使用。例如装载好探针的细胞共1mL，可以加入1μL的阳性对照刺激。通常刺激后20～30分钟内可以观察到非常显著的活性氧水平升高。对于不同的细胞，活性氧阳性对照的效果可能有较大的差别。如果在刺激后30分钟内观察不到活性氧的升高，可以适当提高活性氧阳性对照的浓度。如果活性氧升高得过快，可以适当降低活性氧阳性对照的浓度。

另外，对于某些细胞，如果发现没有刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可以按照1∶2000～1∶5000稀释DCFH-DA，使装载探针时DCFH-DA的浓度为2～5μmol/L。探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整。

活性氧阳性对照（Rosup）仅仅用于作为阳性对照的样品，并不是在每个样品中都需加入活性氧阳性对照。

注意事项：

1. 探针装载后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。

2. 探针装载完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的装载情况是否良好。DCF的激发光谱和发射光谱请参考上图。

3. 尽量缩短探针装载后到测定所用的时间（刺激时间除外），以减少各种可能的误差。

4. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

5. 定量的话要作标准曲线吧。先做一个不同浓度H₂O₂氧化DCFA荧光值，做一条标准曲线，X轴为H₂O₂浓度，y轴是荧光值，得出一个方程，在看你样品的荧光值即Y值是多少，对应的X值就是。

6. 有的细胞装载探针后细胞容易漂起来，洗细胞时实验组会吸走一部分细胞。所以种细胞时细胞量增加一倍，这样细胞紧密连接，贴壁比较牢，实验组的荧光值就高了。另外的H2DCFDA很敏感，工作液浓度要低一些，1-2μM就够啦，浓度太高容易有非特异性染色。这个探针很不稳定，一旦氧化了本底荧光值就会升高，最好工作液现用现配。

仅供科学研究使用，禁止用于它用。

美国Zeta Life公司成立于1989年，是国际无血清细胞培养基DMEM/F12主要完成人，有三十多年的胎牛血清、无血清细胞培养基、以及干细胞、免疫细胞及肿瘤细胞等多种不同类型哺乳动物细胞的无血清培养液生产经验；也是目前世界胎牛血清、无血清培养基最大的供应商之一；每批血清均有完整的血源证明文件、兽医师检验证明及品质测试报告；

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